Os resultados foram publicados na revista Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS).Como explicou Giordano, o principal obstáculo para o desenvolvimento de drogas capazes de se ligar aos vasos sanguíneos cerebrais é a chamada barreira hematoencefálica, estrutura que protege o sistema nervoso central de substâncias potencialmente tóxicas presentes no sangue. No entanto, os testes com camundongos mostraram que a ligação da FRW com os vasos cerebrais ocorre justamente na junção das células da barreira hematoencefálica.
Além de gerar um mapa vascular completo do cérebro, a nova técnica poderia também detectar a perda da integridade da barreira hematoencefálica, uma possível causa de doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson.
“Teoricamente, se a FRW não se ligar ao sistema vascular cerebral, é sinal de que a barreira está prejudicada”, disse Giordano à Agência FAPESP.
Para realizar o estudo, os pesquisadores usaram uma biblioteca de bacteriófagos (ou fagos), uma coleção de vírus capazes de infectar apenas bactérias. Por serem inofensivos a outros organismos, podem ser usados como carreadores de moléculas.
“Cada um dos fagos da biblioteca é modificado por meio de engenharia genética para ter em sua superfície um peptídeo [pedaço de proteína] diferente do que teria o vírus original. Esse peptídeo carrega um marcador, que é detectado quando se liga a proteínas específicas, sejam do sistema vascular do cérebro, de tumores, rins ou outras regiões do organismo”, disse Giordano.
A técnica, conhecida como phage display, rendeu aos seus criadores – George P. Smith e Gregory P. Winter – o Prêmio Nobel de Química em 2018. Criada em 1985, foi adaptada para aplicação em animais vivos na década seguinte pela brasileira Renata Pasqualini, pesquisadora da Rutgers University, nos Estados Unidos, e uma das autoras do artigo publicado na PNAS.
A pesquisa começou a ser desenvolvida ainda em 2011, no projeto de iniciação científica de Fenny Hui Fen Tang, primeira autora do artigo. Posteriormente, Tang continuou o estudo durante o mestrado e o doutorado, concluído recentemente no IQ-USP.
O trabalho contou ainda com financiamento da FAPESP por meio de Auxílio à Pesquisa nas modalidades Apoio a Jovens Pesquisadores e Regular.
Para chegar à molécula, os pesquisadores injetaram em camundongos uma biblioteca inteira, com cerca de 10 bilhões de fagos diferentes. Os vírus modificados circularam pela corrente sanguínea e, embora a maioria tenha sido eliminada pelo organismo, alguns se ligaram à vasculatura de diferentes órgãos e tecidos, entre eles à barreira hematoencefálica.
Esses fagos foram resgatados dos cérebros dos animais e cultivados em bactérias, a fim de que se multiplicassem. A nova geração de microrganismos foi injetada em outros camundongos para aprimorar a seleção e, após três ciclos, aproximadamente 3 mil fagos se ligaram aos vasos do cérebro.
“Nesse processo, os peptídeos com maior afinidade com o sistema vascular cerebral foram vencendo a seleção e aumentando em número”, explicou Giordano.
Dos cerca de 3 mil peptídeos que aderiram à barreira hematoencefálica, em 1.021 estavam presentes uma sequência de três aminoácidos: fenilalanina, arginina e triptofano.
“Vimos que esse peptídeo é um marcador panvascular do cérebro, ou seja, reconhece todos os vasos cerebrais. Porém, não se liga a vasos de outros tecidos que também são protegidos por barreira, como os do cólon e do intestino”, disse o pesquisador.
Para a surpresa do grupo de Giordano, a FRW não se ligou aos vasos da retina, até então considerada uma extensão do sistema nervoso.
“Acreditava-se que a barreira protetora dos vasos da retina era muito semelhante ou mesmo idêntica à barreira hematoencefálica. E acabamos vendo uma diferença, pelo menos nos camundongos, por conta dessa molécula”, disse. Esse achado, por si só, dá margem a novos estudos sobre a chamada barreira hematorretiniana.
Molécula sintética
Diante de dificuldades para identificar o receptor celular em que os fagos se ligavam por técnicas bioquímicas, a equipe do IQ-USP se uniu a pesquisadores do Instituto Adolpho Lutz, em São Paulo. Especialistas na técnica de miscroscopia eletrônica por transmissão (TEM, na sigla em inglês), eles ajudaram não só a visualizar a molécula no cérebro dos animais vivos como demonstraram que a ligação com os vasos ocorre na junção das células da barreira hematoencefálica.
A estrutura é conhecida em inglês como tight junction (“junção justa”, numa tradução livre), exatamente por ter uma "cola" tão forte que não deixa substâncias estranhas, nem mesmo a água, atravessarem a barreira hematoencefálica.
“Agora precisamos detalhar isso melhor, pois há várias moléculas que compõem essa estrutura”, disse Giordano.
O passo seguinte foi sintetizar o peptídeo e averiguar se a versão produzida em laboratório teria a mesma ação da FRW nos animais. Os pesquisadores acreditam que a versão sintética também se liga aos vasos sanguíneos cerebrais, porém não foi possível visualizá-la in vivo.
Outro aspecto da pesquisa será explorar os demais peptídeos selecionados que não contêm FRW e selecionar os que permanecem em algumas regiões específicas do cérebro, como cerebelo, bulbo olfatório e os hemisférios, permitindo futuramente exames ainda mais específicos.
O artigo A ligand motif enables differential vascular targeting of endothelial junctions between brain and retina (doi: 10.1073/pnas.1809483116), de Fenny H.F. Tang, Fernanda I. Staquicini, André A.R. Teixeira, Jussara S. Michaloski, Gislene M. Namiyama, Noemi N. Taniwaki, João C. Setubal, Aline M. da Silva, Richard L. Sidman, Renata Pasqualini, Wadih Arap e Ricardo J. Giordano, pode ser lido em: www.pnas.org/content/116/6/2300.
Agência FAPESP
