Em artigo publicado nesta quinta-feira na revista Molecular Cell, pesquisadores da Cornell University, nos Estados Unidos, descreveram uma nova técnica que permite entender detalhadamente a ação de enzimas responsáveis por proteger o genoma contra problemas ocorridos durante o processo de replicação do DNA. Entre os autores estão os brasileiros Marcus Bustamante Smolka e José Renato Cussiol, ex-bolsistas de doutorado da FAPESP atualmente em Cornell, além de Francisco Bastos de Oliveira, recém-contratado como professor da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).
“Essa nova técnica poderá ajudar no desenvolvimento de drogas com ação mais específica contra diferentes tipos de câncer e no entendimento de doenças relacionadas com o mau funcionamento de enzimas conhecidas como quinases, que regulam todos os processos importantes no interior das células”, afirmou Smolka.
As quinases são responsáveis por catalisar uma reação química conhecida como fosforilação, que é a transferência de um grupo fosfato de moléculas de alta energia, como o ATP (adenosina trifosfato), para proteínas-alvo (substratos).
Essa reação pode fazer, dependendo do caso, com que a proteína-alvo seja ativada, desativada ou, ainda, sinalizar para que a molécula seja degradada. Dessa forma, as quinases regulam processos como divisão, proliferação e diferenciação celular, entre outros.
“Das mais de 500 quinases descritas no genoma humano, estima-se que entre cinco e dez tenham o papel de orquestrar a defesa celular contra eventuais problemas na replicação do DNA”, contou Smolka.
Esses erros costumam ocorrer momentos antes de a célula se dividir, quando as fitas de DNA existentes no núcleo se abrem para que o código genético possa ser copiado.
“Da fecundação de um óvulo à formação de um organismo adulto, o genoma precisa ser replicado mais de 10 trilhões de vezes. A célula precisa ter um sistema para detectar e lidar com os defeitos no processo de cópia, caso contrário, ocorre um acúmulo de danos ao genoma que torna a vida inviável. As quinases são essenciais nesse processo de contenção de danos”, disse Smolka.
Ao detectar o dano, as quinases acionam diversas "equipes de socorro" na tentativa de evitar que a célula morra. “É como se houvesse um grande vazamento na cidade e a enzima fosse a responsável por desligar a água, avisar os moradores, chamar um grupo de reparo, avisar os policiais para que interrompam o trânsito e assim por diante. Mas como essa sinalização acontece ainda não era entendido”, disse.
No trabalho publicado na Molecular Cell, o grupo de Cornell desvendou como atuam três dessas enzimas dedicadas a proteger o genoma. São as equivalentes em leveduras às quinases humanas ATR, ATM e CHK1.
Considerando que em uma única célula pode haver simultaneamente mais de 20 mil radicais fosfato sendo transferidos de um lugar para outro por diferentes quinases, descobrir o que cada uma dessas enzimas está fazendo não é uma tarefa trivial. Para conduzir essa investigação, os pesquisadores utilizaram um espectrômetro de massa, aparelho capaz de medir a massa de moléculas com altíssima precisão.
“Extraímos as proteínas das células de levedura e as quebramos em vários pedaços. O espectrômetro consegue medir a massa de cada um desses pedaços e identificar se há um grupo fosfato ligado a ele ou não. Dessa forma conseguimos saber de onde e para onde os radicais vão sendo transferidos. A precisão é tão alta que sabemos até a qual resíduo de aminoácido da proteína-alvo o grupo fosfato se ligou”, disse Smolka.
O mapa das quinases
Somente para a enzima ATR, que atraiu maior atenção dos cientistas, foram identificados mais de 100 diferentes substratos. Para isso, os cientistas criaram três linhagens mutantes de levedura – a primeira sem o gene da ATR, a segunda sem o gene da ATM e a terceira, sem o CHK1.
“Com essa técnica, conseguimos detectar mais de 6 mil eventos de fosforilação. Ao comparar a célula normal com uma das mutantes, conseguíamos observar quais desses eventos desapareciam. Assim foi possível identificar os substratos de cada uma das enzimas”, contou.
Além disso, foram desenvolvidos mapas quantitativos – batizados de Qmaps (Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Phospho-substrates) – capazes de mostrar como, em diferentes condições, a fosforilação de cada um dos substratos era modificada.
“Conseguimos ver, por exemplo, se uma determinada droga que causa dano ao DNA aumenta ou diminui os eventos de fosforilação em cada uma das proteínas-alvo. Ou seja, conseguimos descobrir não apenas quando e como a ATR é ativada como também em que nível seus diferentes substratos estão sendo regulados”, disse Smolka.
Para surpresa dos pesquisadores, os Qmaps revelaram que a ATR não entra em ação apenas quando há dano no genoma. A enzima também atua preventivamente.
“Ela está sempre ativada e, em vez de sinalizar para quatro ou cinco proteínas como era esperado, ela regula centenas. O processo é bem mais complexo que o previsto”, disse.
De acordo com Smolka, já existem inibidores de ATR sendo testados clinicamente contra o câncer. Como as células malignas se dividem de forma acelerada e descontrolada, são muito mais dependentes da ação da ATR para sobreviver do que uma célula normal.
“É como se houvesse vários vazamentos por toda a cidade, mas ainda assim a célula do câncer consegue sobreviver. Os Qmaps podem ajudar a descobrir em quais situações e de que forma essa quinase deve ser inibida para matar diferentes tipos de câncer com interferência mínima em células normais”, disse Smolka.
Ainda segundo o pesquisador, a técnica também pode ser usada por outros grupos de pesquisa dedicados a desvendar o papel das quinases tanto no organismo humano como no de outros animais e plantas.
Estudos já mostraram que essas enzimas são importantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. Estima-se que, das mais de 500 quinases identificadas no genoma humano, menos que 100 tenham sido bem estudadas até o momento.
“Estamos fazendo agora experimentos semelhantes com os descritos na revista com linhagens de células humanas. Gostaríamos de conectar o trabalho que temos desenvolvido aqui em Cornell com várias iniciativas interessantes que estão acontecendo em São Paulo”, afirmou Smolka.
Mais informações sobre a pesquisa podem ser obtidas no site: http://smolka.wicmb.cornell.edu/. O artigo Phosphoproteomics Reveals Distinct Modes of Mec1/ATR Signaling during DNA Replication (doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.01.043, pode ser lido em http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(15)00092-1.
Agência FAPESP
