O foco estava nos exemplares quitinolíticos – ou seja, nas bactérias que metabolizam a quitina (polissacarídeo presente no exoesqueleto de muitos organismos marinhos) e liberam carbono e nitrogênio (utilizados em processos biológicos, fisiológicos e bioquímicos ao longo de toda a cadeia alimentar).
Após as fases de coleta e análise, foram encontrados 13 gêneros de bactérias quitinolíticas na Baixada Santista, 19 em Ubatuba e 28 em São Sebastião, somando as amostras de água do mar e de plâncton (alguns gêneros foram encontrados tanto em água do mar quanto em plâncton).
Por meio de estudos anteriores realizados pelo próprio ICB/USP, os pesquisadores conheciam os níveis de poluição antrópica (pelo homem) nos três locais: alto na Baixada Santista, médio em São Sebastião e baixo em Ubatuba.
Cruzando os resultados, concluiu-se que a maior diversidade é encontrada onde há poluição baixa ou mediana. “Os microrganismos nativos de um sistema competem com outros que chegam até ele, por meio de esgotos não tratados, por exemplo. E sobrevivem os mais fortes – no caso, aqueles associados aos poluentes”, disse Irma Nelly Gutierrez Rivera, professora e pesquisadora do ICB/USP.
De acordo com Rivera, tal redução na diversidade de bactérias quitinolíticas gera preocupações em ao menos três esferas. A primeira remete aos prejuízos diretos para a cadeia alimentar marinha, que necessita do carbono e do nitrogênio liberados pela metabolização da quitina. A segunda diz respeito a perdas para uma série de processos biotecnológicos nos quais essas bactérias são aplicáveis, como controle de insetos e fungos.
Já a terceira implica em riscos relacionados à perda de biodiversidade nos ecossistemas costeiros do país. “Há espécies desaparecendo antes mesmo de serem catalogadas. Isso é ruim porque devemos saber o que é nosso e o que não é – caso, por exemplo, dos microrganismos que chegam com a água de lastro dos navios e cuja interação com as espécies locais pode dar origem a espécies patogênicas que, por sua vez, podem causar doenças para o homem, para os animais marinhos e para o próprio ecossistema”, disse Rivera.
Metodologias e desenvolvimento
Entre 2007 e 2010, Rivera coordenou uma pesquisa com Auxílio Regular da FAPESP sobre a diversidade de microrganismos marinhos na Baixada Santista, em Ubatuba e em São Sebastião.
A partir de então e até o segundo semestre de 2012, com novo projeto de pesquisa, Rivera passou a coordenar a caracterização das comunidades bacterianas nesses três locais. Ou seja, a equipe focou os estudos nas bactérias – mais especificamente nas quitinolíticas – e buscou identificá-las por meio de análises moleculares e genéticas.
Para tanto, o primeiro passo foram as coletas de amostras de água e plâncton, que duraram 20 meses em São Sebastião e dois verões em Ubatuba e na Baixada Santista. As amostras de água eram coletadas em volumes de cinco litros, dez centímetros abaixo da superfície, em frascos previamente esterilizados. As amostras de plâncton foram coletadas com rede de malha, por arraste, durante cinco minutos, nos mesmos pontos de coleta das amostras de água.
A partir de então, o estudo das bactérias quitinolíticas viáveis (que podem ser cultivadas) foi realizado em meio de cultura que continha apenas quitina como fonte de carbono e alguns sais, de modo que o meio tivesse uma composição próxima à da água do mar. As bactérias quitinolíticas foram identificadas, em nível de gênero, com o método de sequenciamento do gene 16S rRNA.
Além dessa metodologia – chamada dependente de cultivo por exigir um meio em que as bactérias possam crescer – os pesquisadores usaram recursos moleculares e fizeram a construção de bibliotecas genômicas que viabilizam o trabalho a partir dos genes (ao invés do crescimento bacteriano), conhecidos como independentes de cultivo. Para tanto, amostras de água foram filtradas e concentradas, com posterior extração do DNA total.
A construção de bibliotecas genômicas foi realizada com o uso do gene chiA, que codifica as enzimas quitinases que degradam a quitina, e da técnica de clonagem – cada sequência foi analisada por meio de pareamento com sequências disponíveis em banco de dados (GenBank).
De acordo com a pesquisadora, caracterizar comunidades bacterianas com base em análises moleculares e genéticas é importante porque permite ampliar o leque de exemplares descritos, já que nem todos são capazes de crescer nos meio de cultivo dos quais os cientistas dispõem.
No caso do estudo do ICB/USP, as duas metodologias, dependente e independente de cultivo, confirmaram que a maior diversidade de bactérias ocorre em ambientes com nível de poluição baixo ou médio.
Nos três locais estudados, o filo Proteobacteria foi o mais recorrente. Em relação aos gêneros, em amostras de água, Micromonospora predominou em Ubatuba e São Sebastião, enquanto Aeromonas prevaleceu na Baixada Santista. Em amostras de plâncton, Ubatuba teve outros gêneros de bactérias, como Streptomyces e Luteimonas, enquanto as Aeromonas foram as mais encontradas em São Sebastião e na Baixada Santista.
“Para chegar ao nível das espécies, é preciso lançar mão de metodologias mais complexas”, afirmou Rivera. “Até hoje, conhecemos pouquíssimas espécies. Estudos apontam que os oceanos são os ambientes mais ricos em diversidade procariótica, com aproximadamente 3,5 x1030 espécies de bactérias. Por enquanto, apenas cerca de 6 mil delas estão descritas.”
Os pesquisadores do ICB/USP farão o sequenciamento completo do genoma de ao menos uma das bactérias quitinolíticas coletadas, a fim de identificar a que espécie ela pertence. Outro desdobramento serão estudos sobre as enzimas produzidas por bactérias de ecossistemas marinhos e suas possíveis aplicações biotecnológicas.
“Estamos na etapa final das análises estatísticas e já submetemos um artigo que aguarda publicação – Impact of Anthropogenic Activity on Chitinolytic Bacteria Diversity in the Marine Environment, disse Rivera. Além dela, duas alunas de pós-doutorado participaram dos estudos: Claudiana Paula de Souza, com bolsa da FAPESP, e Bianca Caetano de Almeida.
Agência FAPESP
